METODI ANALITICI PER LA DETERMINAZIONE QUALITATIVA E QUANTITATIVA DEI CURCUMINOIDI DI OXITURMERIC®

I curcuminoidi di OxiTurmeric® sono analizzati mediante HPLC-DAD accoppiata a ESI- spettrometria di massa/massa. L’accurata quantificazione dei curcuminoidi curcumina (CUR), demetossicurcumina (DMC) e bis-demetossicurcumina (BDMC) di OxiTurmeric® si basa sul metodo ufficiale AOAC 2016.16. Dopo l’estrazione con metanolo e la dovuta diluizione, l’estratto viene analizzato mediante HPLC impostando il rivelatore DAD a 425 nm, la colonna C18 (2,6 μm, 2,1 × 30 mm) a 55 ° C di temperatura, utilizzando un volume di iniezione di 0,8 μL e un flusso velocità di 1,4 mL / min. Viene quindi calcolata la concentrazione reale dei curcuminoidi in base a curve di calibrazione ottenute su standard puri. L’identificazione dei curcuminoidi è effettuata tramite HPLC-DAD-ESI-MS/MS.

Molto spesso siamo abituati a vedere affermazioni di curcuminoidi presenti al 95-98%. Qui riportiamo un esempio di un campione di curcuma che vanta di possedere il 98% di curcuminoidi, ma che alla fine si è dimostrato contenere una percentuale reale del 63% di curcuminoidi totali. In pochi passaggi mostreremo come viene eseguita un’analisi tipica dei curcuminoidi.

Il cromatogramma ottenuto da un estratto commerciale di curcuma che vanta il 98% di curcuminoidi è riportato in Figura 1

Figura 1. Cromatogramma di un estratto di curcuma che vanta il 98% di curcuminoidi.

Leggendo a una lunghezza d’onda fissa (di 425 nm) si prevede che solo i curcuminoidi compaiano nel cromatogramma. Pertanto, se calcoliamo la percentuale totale dei curcuminoidi mostrati in Figura 1 otteniamo i risultati della Tabella 1, dove in realtà le percentuali totali di curcuminoidi sono addirittura superiori al 98% dichiarato.

Tabella 1. Percentuale totale delle aree dei picchi della Figura 1

Composto Tempo di ritenzione (min) Area calcolata Percentuale dell’area
Non identificato 13.03 134.14 0.7%
BDMC 14.88 2355.26 13.0%
DMC 15.34 3136.64 17.3%
Curcumin 15.81 12543.10 69.0%
TOTALE 18169.14 100.0%
Curcuminoidi totali 99.3%

Un errore comune è quello di considerare le percentuali della Tabella 1 come una misura quantitativa dei curcuminoidi presenti nell’estratto di curcuma analizzato. Per quantificare il contenuto reale dei curcuminoidi, la quantificazione viene eseguita con la calibrazione esterna rispetto agli standard di riferimento per CUR, DMC e BDMC, secondo il metodo ufficiale AOAC 2016.16. Per ottenere queste curve, la concentrazione dell’analita (asse x) viene tracciata rispetto all’area del picco integrato individuale per CUR, DMC e BDMC (asse y). L’analisi dei quadrati minimi e la retta di regressione vengono utilizzate per determinare la pendenza, l’intercetta e il coefficiente di determinazione (R2) della linea più adatta per ciascun analita.

Le Figure 2-4 mostrano le tipiche curve di calibrazione ottenute rispettivamente su standard puri di CUR, DMC e BDMC.

Figura 2. Curva di calibrazione calcolata con lo standard curcumina.

Figura 3. Curva di calibrazione calcolata con lo standard demetossicurcumina.

Figura 4. Curva di calibrazione calcolata con lo standard bisdemetossicurcumina.

Sulla base di queste curve di calibrazione esterne, la quantità di curcuminoidi nel campione originale viene calcolata come segue:

dove C = concentrazione dell’analita dalla curva standard; V = volume estratto; W = peso del campione saggiato (g); e D = fattore di diluizione.

Prendendo in considerazione il calcolo di cui sopra, i dati della Tabella 1 vengono quindi trasformati nei dati quantitativi della Tabella 2

 

Table 2. Analisi quantitativa dei dati della Tabella 1 e della Figura 1 in base alle curve di calibrazione delle Figure 2-4.

Composto Tempo di ritenzione (min) Area calcolata Percentuale dell’area μg dalla curva di cal. mg/g del campione % reale nel campione
Non identificato 13.03 134.14 0.7% nd nd
BDMC 14.88 2355.26 13.0% 0.023 45.7 4.6%
DMC 15.34 3136.64 17.3% 0.043 85.4 8.5%
Curcumin 15.81 12543.10 69.0% 0.248 492.7 49.3%
TOTALE 18169.14 100.0% 0.314 623.8 62.4%
Curcuminoidi totali 99.3% 62.4%

Pertanto, l’uso corretto delle curve di calibrazione mostra come la percentuale totale di curcuminoidi nel campione che vantava una percentuale totale di curcuminoidi del 98% è in realtà del 62,4%

Un’ulteriore conferma dell’identità dei curcuminoidi è data dall’accoppiamento dell’HPLC con una sorgente elettrospray e spettrometria di massa in tandem. Gli spettri di massa tipici di CUR, DMC e BDMC sono illustrati nelle Figure 5-7.

Figura 5. Frammentazione di massa della Curcumina.

Figura 6. Frammentazione di massa della Demetossicurcumina.

Figura 7. Frammentazione di massa della Bis-demetossicurcumina.

METODI ANALITICI PER LA DETERMINAZIONE QUANTITATIVA E QUALITATIVA DEI SISQUITERPENI BISABOLANICI VOLATILI DI OXITURMERIC®

I sesquiterpeni bisabolanici (ad es. Ar-turmerone, α-turmerone, β-turmerone) presenti in OxiTurmeric® sono identificati mediante gascromatografia accoppiata a spettrometria di massa (GC-MS) e quantificati mediante gascromatografia accoppiata a rivelatore a ionizzazione di fiamma (GC-FID ). Questi sono gli unici metodi affidabili per l’analisi dei composti bioattivi volatili della curcuma. Altri metodi (tra cui TLC, UV-Vis, ecc.) non forniscono né l’identificazione precisa dei composti (possibile solo tramite GC-MS) né la loro precisa quantificazione (ottenuta utilizzando GC-FID con curve di calibrazione esterne di standard puri e l’impiego di standard interni).

Il tipico profilo GC-FID di OxiTurmeric® è illustrato nella Figura 8.

Figura 8. Cromatogramma GC-FID di OxiTurmeric® che mostra la presenza di diversi sesquiterpeni. Questa analisi viene utilizzata per la determinazione quantitativa dei sesquiterpeni volatili bioattivi di OxiTurmeric® utilizzando sia le curve di calibrazione esterne con standard puri che tramite l’utilizzo di standard interni (come ad esempio il trans-nerolidolo).

L’identificazione dei principali sesquiterpeni di OxiTurmeric® è ottenuta tramite GC-MS come mostrato nella Figura 9.

Figura 9. Spettri di massa dei principali sesquiterpeni bisabolanici contenuti in OxiTurmeric®. Ogni singolo lotto è sottoposto a severi controlli GC-FID e GC-MS per fornire sempre un prodotto standardizzato.

OXITURMERIC® È BIODISPONIBILE A LIVELLO CELLULARE – COME DIMOSTRATO SU CELLULE UMANE HEPG2

La capacità antiossidante degli alimenti e degli integratori alimentari è spesso misurata dalla reazione chimica dell’estratto vegetale o ingrediente con fonti di ROS. I metodi più utilizzati sono: ORAC, TRAP, FRAP, TEAC, DPPH, ecc. Questi test sono test chimici tradizionali che non danno informazioni sulle funzioni fisiologiche degli antiossidanti e sono stati screditati per anni e fortemente criticati dalle principali autorità di monitoraggio sanitario (come ad esempio, EFSA e USDA).

Questo è il motivo per cui abbiamo testato la biodisponibilità e la capacità di OxiTurmeric® di attivare le risposte a livello cellulare utilizzando la tecnologia innovativa basata su LUCS (Light-Up Cell System) un approccio brevettato (EP2235505 e US20110008783) sviluppato dalla Anti Oxidant Power Company, Toulouse , Francia (per ulteriori dettagli, vedere gli approfondimenti su OxiP®).

Per dimostrare che OxiTurmeric® è biodisponibile a livello cellulare, abbiamo eseguito il saggio biologico ARE/Nrf2 su di cellule vive, che utilizza un gene reporter che misura la capacità del campione di attivare la sequenza di promotore del DNA ARE (Antioxidant Response Element) dopo il rilascio nucleare del fattore di trascrizione Nrf2 dal complesso citosolico Keap1/Nrf2. Questa via genomica, nota anche come “la difesa naturale antiossidante delle cellule“, ha la capacità di aumentare la capacità delle cellule di adattarsi allo stress ossidativo o al danno cellulare (Ma, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 2013: 53: 401-426). La via Nrf2-ARE mostra cambiamenti dinamici ed è stata studiata per il suo ruolo neuroprotettivo (Gan & Johnson, Biochim. Biophys, Acta-Mol. Basis Dis. 2014,1842: 1208-1218). Nelle cellule HepG2-Nrf2, la sequenza di promotore di ARE è accoppiata all’espressione dell’enzima luciferasi che, in presenza di luciferina, catalizza la produzione del composto luminescente ossiluciferina.

OXITURMERIC® AGISCE DA CITOPROTETTORE ATTRAVERSO L’ATTIVAZIONE DELLA VIA ARE/NRF2

OxiTurmeric® ha la capacità di agire a livello cellulare, mostrando così una chiara biodisponibilità. L’interazione di OxiTurmeric® provoca un evidente effetto sulla difesa cellulare antiossidante naturale di cellule umane HepG2 (la via ARE/Nrf2). Sono state valutate diverse concentrazioni per determinare la massima espressione genica. Il valore più elevato di espressione genica (5.11 volte rispetto al controllo) si ottiene con una concentrazione di 12.5 mg/ml, mentre la minima concentrazione in grado di attivare l’espressione genica è di 6.25 mg/ml (Figura 10).

Figura 10. Effetto di OxiTurmeric® sulla via ARE/Nrf2. La variazione dell’espressione genica rappresenta la capacità di OxiTurmeric® di aumentare la difesa cellulare antiossidante naturale in cellule umane HepG2. A 12,5 mg/ml, OxiTurmeric® attiva 5 volte di più le auto-difese antiossidanti delle cellule rispetto al controllo.

L’assenza di additivi esterni e la pura caratteristica “tutta naturale” di OxiTurmeric® mostrano una EC50 di 5,60 mg/ml, senza alcun effetto citotossico osservato dopo 17 ore di trattamento a qualsiasi concentrazione saggiata (Figura 11). La biodisponibilità e la capacità di attivazione genica di OxiTurmeric® è garantita dalla presenza naturale di un alto livello di curcuminoidi insieme ai turmeroni volatili, che aumentano la biodisponibilità senza l’aggiunta di altre molecole sintetiche.

Figura 11. Rappresentazione grafica dose-risposta di OxiTurmeric® ottenuta su esperimenti eseguiti in triplicato. I dati mostrano che OxiTurmeric® non è citotossico e che l’EC50 (che è una concentrazione di efficacia del 50%, calcolata sull’adattamento sigmoideo dose-risposta) è di 5,60 mg/ml con un elevato coefficiente di determinazione (R2 = 0,984). Le barre rappresentano la deviazione standard.

In conclusione, OxiTurmeric® mostra una biodisponibilità dimostrata a livello cellulare in cellule umane HepG2. OxiTurmeric® attiva le difese naturali antiossidanti delle cellule umane e non mostra effetti citotossici a tutte le concentrazioni esaminate. OxiTurmeric®, agendo sulla via ARE/Nfr2 ha la potenzialità di aumentare la capacità delle cellule di adattarsi allo stress ossidativo o al danno cellulare stimolando anche la neuroprotezione.

OXITURMERIC® NON CONTIENE ZEDERONE

Presenza del composto epatotossico ZEDERONE negli estratti di curcuma

Diversi studi hanno dimostrato che alcuni sesquiterpeni (ad es., Zederone, Figura 12) mostravano tossicità epatica, che si basa principalmente sulla formazione di metaboliti reattivi, aumento della concentrazione di specie reattive dell’ossigeno e compromissione della difesa antiossidante (Zarybnicky et al., 2018, Archives of Toxicology, 92 (1): 1-13).

Figura 12. Spettro di massa e struttura chimica del composto tossico zederone

La sofisticazione della Curcuma può avvenire tramite miscelazioni con Curcuma comosa Roxb. ampiamente coltivata in Tailandia come fonte per la medicina tradizionale wan chak motluk, comunemente usata per il trattamento dei sintomi della menopausa (contiene diarileptanoidi estrogenici), o con Curcuma elata, il cui rizoma contiene un’alta percentuale del sesquiterpene zederone (Pimkaew et al. 2013, Toxicol In Vitro 27: 2005-2012). L’epatotossicità del sesquiterpene zederone è stata dimostrata in estratti di Curcuma elata (Pimkaew et al 2013, Int J Toxicol 32: 454-462). Lo zederone è anche un tipico sesquiterpene trovato in Curcuma kwangsiensis (Liu et al, 2016, Chin Med 11:21), Curcuma zedoaria (Hamdi et al, 2014, Scientific World Journal, numero articolo: 321943) e in Curcuma amada Roxb (Akter, et al, 2019, Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, 12 (3): 123-129), dove mostra una forte citotossicità contro le cellule KG1a (Anuchapreeda et al, 2018, Natural Product Communications, 13 (12): 1615-1618).

OxiTurmeric® non contiene zederone come dimostrato dalle nostre analisi GC-MS

La ricerca dei frammenti di massa del sesquiterpene zederone in OxiTurmeric® ha dimostrato la completa assenza di questo composto, indicando che OxiTurmeric® è sicuro ed è prodotto esclusivamente da piante di Curcuma longa.

OXITURMERIC® È NATURALE AL 100% COME DIMOSTRATO DALLE ANALISI 14C

Abbiamo ricercato la possibile presenza di sostanze artificiali in OxiTurmeric® attraverso l’analisi del radiocarbonio 14C. La curcuma naturale ha un livello di 14C del 100% di origine organica. D’altra parte, la curcuma prodotta interamente da componenti derivati dal petrolio ha un livello di 14C dello 0% ed è quindi naturale allo 0%. Un prodotto costituito da biomassa (estratti vegetali) e sostanze chimiche a base di petrolio o addizionato con molecole sintetiche avrà un contenuto organico naturale tra 0% e 100% proporzionatamente alla quantità di ciascun componente nel prodotto.

Il valore di OxiTurmeric® 14C è del 99,9% ± 3,7 indicando la pura origine naturale dell’estratto.