ANALISI CHIMICA DELLE PAC

IL CONTENUTO DI PAC PRESENTI IN OXIMACRO® È DETERMINATO CON IL METODO BL-DMAC, MA QUESTO METODO NON DISTINGUE LE PAC-A DALLE PAC-B.

Quando abbiamo misurato gli standard di PAC-A e PAC-B con il metodo BL-DMAC, abbiamo notato che la stessa quantità di PAC reagisce in modo diverso con vari spettri di assorbanza. In particolare, si nota una assorbanza a 640 nm più elevata per le PAC-B rispetto alle PAC-A anche se la curva di calibrazione è ottenuta con uno standard di PAC-A2. Così in un campione di cranberry la presenza di PAC-B sovrastima il contenuto totale delle PAC-A.

Il grafico qui sotto mostra lo spettro di assorbimento degli standard di PAC-B e PAC-A. Le PAC-B mostrano un’assorbanza superiore rispetto alle PAC-A, anche quando le due PAC sono usate alla stessa concentrazione.

The PACs content of Oximacro® is determined by the BL-DMAC method
L’ANALISI IN HPLC-ESI-MS/MS DI OXIMACRO® È UN METODO IN GRADO DI VALUTARE IL CONTENUTO PRECISO DELLE PAC-A, CHE SONO GLI UNICI COMPOSTI BIOATTIVI PER LE INFEZIONI URINARIE E CHE POSSEGGONO ATTIVITÀ ANTIVIRALE.

La figura sotto mostra il cromatogramma HPLC-ESI-MS/MS eseguito in modalità MRM che mostra la presenza di numerosi dimeri di PAC-A tipici di Oximacro®.

MS/MS spectra in negative mode of a typical PAC-B dimer

Il grafico sotto riportato mostra gli spettri MS/MS in modalità negativa di un tipico dimero di PAC-B ([M- H]-1 577 m/z) e di un tipico dimero di PAC-A ([MH]-1 575 m/z).

PAC-B A PAC-A

 

IN BASE ALLE ANALISI EFFETTUATE CON BL-DMAC e HPLC-MS OXIMACRO® CONTIENE:
360 mg/g DI PAC TOTALI di cui 86% sono PAC-A

 

Per una descrizione completa dei metodi e dei risultati si rimanda al documento:

MAFFEI, M.E. (2016)
Caratterizzazione e quantificazione delle proantocianidine negli estratti di cranberry.
Natural1, 16 (154): 26-32 (download pdf).

UN VALIDO SUPPORTO PER IL BENESSERE DELLE VIE URINARIE

Per valutare l’effetto di Oximacro®, abbiamo reclutato una popolazione di volontari (10 maschi e 60 femmine). I criteri di inclusione comprendevano ogni donna o uomo da almeno 18 anni di età a più di 51 anni di età con documentazione di almeno 2 episodi di cistite comprovata da urinocultura nel corso dell’anno solare prima del reclutamento. Il gruppo sperimentale (5 maschi e 30 femmine) ha ricevuto 1 capsula contenente 36% di PAC-A due volte al giorno (mattina e sera = 72 mg PAC-A al giorno) per 7 giorni, mentre al gruppo placebo (5 maschi e 30 femmine) è stato dato lo stesso numero di capsule senza PAC. Un punteggio (da 0, che rappresenta nessun effetto, a 10, che rappresenta un effetto massimo di Oximacro® nell’alleviare le infezioni urinarie) è stato registrato per tutti i volontari ed i dati sono stati log-trasformati.
Dopo 7 giorni di somministrazione Oximacro® (72 mg PAC-A), è stata trovata una differenza significativa tra i gruppi placebo e Oximacro® sia per le femmine (Mann-Whitney U-test = 875; P <0.001; N = 60) che per i maschi (Mann-Whitney U-test = 24; p = 0,016; N = 10) (figura sotto).

a significant difference was found between the placebo and Oximacro® groups

Quando abbiamo analizzato separatamente le fasce di età dei maschi e delle femmine (vedi figura sotto), la fascia d’età 31-35 femminile ha mostrato solo differenze poco significative tra il placebo e gruppi Oximacro® (Mann-Whitney U-test = 20.5; p = 0.095; N = 10), mentre tutte le altre fasce di età di sesso femminile hanno mostrato differenze molto significative tra il placebo e gruppi Oximacro® (pannello di sinistra) (Mann-Whitney U-test = 25; p = 0,008; n = 10). Tutti i maschi hanno mostrato risposte significative alla somministrazione Oximacro® (pannello di destra).

highly significant differences between the placebo and Oximacro® groups

I risultati di questo lavoro sono in accordo con precedenti studi randomizzati multicentrici, in doppio cieco contro placebo che hanno esaminato gli effetti di 72 mg standardizzati di PAC di cranberry. Inoltre, i nostri risultati mostrano che 72 mg di PAC-A sono molto efficaci e si consiglia nella prevenzione delle infezioni urinarie l’uso di dosaggi basati su PAC-A e non solamente sulle PAC totali. Infatti, a causa dell’impossibilità del saggio BL-DMAC di discriminare le PAC-A dalle PAC-B, la sola quantificazione delle PAC totali può non essere sufficiente a fornire la quantità di PAC-A richiesta e necessaria per inibire significativamente le infezioni urinarie.

Per una descrizione completa dei metodi e dei risultati si rimanda al documento:

Occhipinti, A., Germano, A., Maffei, M.E. (2016)
Prevention of urinary tract infection with Oximacro®, a cranberry extract with a high content of A-type Proanthocyanidins (PAC-A). A pre-clinical double-blind controlled study.
Urology Journal, 13: 2640-2649 (download pdf).

ATTIVITÀ ANTIVIRALE CONTRO L’HERPES

In assenza di vaccini preventivi efficaci, i microbicidi topici offrono una valida alternativa agli analoghi nucleosidici nella prevenzione di infezioni da Herpes simplex di tipo 1 (HSV-1) e tipo 2 (HSV-2). A causa della sua riconosciuto attività anti-adesiva contro i batteri patogeni, Oximacro® può rappresentare una fonte naturale di nuovi microbicidi antivirali.
L’attività antivirale di Oximacro® è stata testato in vitro sulla replicazione di HSV-1 e HSV-2. Il pretrattamento di cellule Vero con Oximacro® 1 h prima dell’infezione ha prodotto una significativa inibizione concentrazione-dipendente dei due isolati clinici di HSV-1 e HSV-2 (vedi figura sotto).

Antiviral activity of Oximacro® on HSV-1 and HSV-2 replication

OXIMACRO® INIBISCE L’ADESIONE DI HSV

L’analisi della modalità d’azione rivelato che Oximacro® impedisce l’adesione di HSV-1 e HSV-2 alle cellule bersaglio. Cellule Vero precongelate sono state trattate con varie concentrazioni di Oximacro®, o eparina a 4 °C per 30 min e poi l’infezione è stata effettuata con HSV-1 oppure HSV-2 preraffreddati ad una MOI di 0,002 per 3 ore a 4 °C in presenza di composti come indicato nella figura sotto riportata. Oximacro® compromette il fissaggio di HSV in modo concentrazione-dipendente e in misura simile a quella osservata nella resa dei virus.

Oximacro® inhibits HSV adsorption

Pertanto, Oximacro®, un estratto di mirtillo rosso altamente arricchito in PAC di tipo A, esercita una potente attività antivirale dose-dipendente contro isolati clinici di HSV-1 e HSV-2, con un meccanismo che comporta l’inibizione dell’attacco iniziale del virus alla superficie delle cellule bersaglio.

Terlizzi et al. (2016) Inhibition of Herpes simplex Type 1 and Type 2 Infections by Oximacro®, a Cranberry Extract with a High Content of A-type Proanthocyanidins (PACs-A). In revisione su Antiviral Research

SOLO LE PAC-A DI OXIMACRO® HANNO AZIONE ANTIVIRALE

La presenza di PAC di tipo A negli estratti di mirtillo rosso è fondamentale per la sua bioattività. La cromatografia utilizzando la gel filtrazione ci ha permesso di frazionare Oximacro® in cinque grandi frazioni, che sono state caratterizzate chimicamente tramite HPLC-ESI-MS/MS e che hanno dimostrato di contenere antociani, flavonoidi, e dimeri e trimeri di PAC-A (vedi figura sotto).

Nella figura sopra sono illustrati: (A) Eluogramma da colonna Sephadex LH20 che mostra il frazionamento di Oximacro®, evidenziando cinque frazioni ben separate. La linea blu corrisponde a valori di assorbanza a 360 nm, mentre la linea tratteggiata arancione corrisponde al saggio BL-DMAC letto a 640 nm. Solo le frazioni 3 e 4 rispondono al saggio BL-DMAC. (B) HPLC-MS della frazione 1 che mostra la presenza di antocianine, come glicosidi di delfinidina e cianidina e di rutina. (C) HPLC-MS della Frazione 2 che mostra la presenza di quercetina e isoramnetina. Infine le analisi chimiche in HPLC-MS delle frazioni 3 e 4 sono dominate da vari isomeri di dimeri di PAC-A (D) e da trimeri di PAC-A (E), mentre la frazione 5 non contiene alcun composto rilevabile.

Per valutare se sia l’estratto totale di mirtillo rosso o se invece siano solo le PAC-A ad esercitate l’attività biologica sul virus Herpes abbiamo analizzato l’attività anti-HSV delle cinque frazioni purificate da Oximacro®. Abbiamo trovato che solo le frazioni 3 e 4, corrispondenti a dimeri e trimeri di PAC-A, sono responsabili dell’attività inibitoria dell’estratto totale di cranberry (Vedere la tabella sottostante).

Frazione Attività citotossica*
(CC50 µg/ml)
Attività antivirale*
(IC50 µg/ml)
HSV-1 HSV-2
1 >200 >75 >75
2 >200 >75 >75
3 188.2 ± 2.3 19.8 ± 3.1 6.8 ± 3.2
4 106.9 ± 1.1 19.2 ± 3.7 7.6 ± 2.2
5 >200 >75 >75
* Concentrazione di Oximacro® che inibisce il 50% della replicazione di HSV come determinato da un saggio di riduzione delle placche. I valori sono la media ± SD di tre esperimenti indipendenti eseguiti in duplicato.

QUINDI, LE PAC-A SONO LE UNICHE MOLECOLE PRESENTI NEL CRANBERRY RESPONSABILI DELLA ATTIVITÀ ANTIVIRALE DI OXIMACRO®. LE ALTRE FRAZIONI PRESENTI NELL’ESTRATTO NON CONTRIBUISCONO ALL’ATTIVITÀ BIOLOGICA CONTRO L’HSV-1 E HSV-2.

COME FUNZIONA OXIMACRO® DA AGENTE ANTIVIRALE?

La rappresentazione schematica mostrato nella figura seguente mostra l’interazione tra le PAC di tipo A presenti in Oximacro® e le glicoproteine dell’involucro esterno del virus HSV. Oximacro® lega l’ectodominio delle glicoproteine di HSV (gD e gB) in modo dipendente sia dalla concentrazione che dal tempo, inibendo quindi le loro funzioni di adesione e ingresso virus nelle cellule. Tuttavia, allo stato attuale, non è ancora chiaro se le interazioni tra le PAC di tipo A di Oximacro® e le glicoproteine che rivestono HSV provochino alterazioni dei domini di proteine specifiche, o se le PAC di tipo A “avvolgano” semplicemente le glicoproteine (come mostrato in la figura qui sotto), impedendo così l’accesso ai loro normali partner di legame sulle cellule bersaglio.

Per una descrizione completa dei metodi e dei risultati si rimanda al documento:

TERLIZZI, M.E., OCCHIPINTI, A., LUGANINI, A., MAFFEI, M.E., GRIBAUDO, G. (2016)
Inhibition of Herpes Simplex Type 1 and Type 2 infections by Oximacro®, a cranberry extract with a high content of A-type Proanthocyanidins (PACs-A).
Antiviral Research 132: 154-164. (download pdf)


Le proprietà anti-UTI e antivirali di Oximacro sono riassunte nel lavoro:

Maffei ME (2016)
Oximacro®, a natural cranberry extract with a very high content of proanthocyanidin A. Prevention of urinary tract infections and antiviral activity
Nutrafoods, 15:N93-N96 – (Read the publication online).

ATTIVITÀ ANTIVIRALE CONTRO L’INFLUENZA (H1N1)

I virus dell’influenza di tipo A e di tipo B (IAV, IBV) sono patogeni principali diffusi tra le popolazioni umane e sono responsabili di epidemie stagionali e pandemie. Le epidemie influenzali annuali causano in tutto il mondo 3-5 milioni di casi di malattie gravi e fino a mezzo milione di morti tra i gruppi ad alto rischio, con un impatto ancora maggiore nei paesi in via di sviluppo. La difesa contro le infezioni da virus dell’influenza (IV) pone ancora una serie di sfide. L’attuale arsenale antivirale contro i virus dell’influenza è in effetti limitato; pertanto, lo sviluppo di nuove strategie anti-influenzali efficaci contro virus antigenicamente diversi è una priorità urgente. Oximacro® inibisce la replicazione dei virus dell’influenza A e B (IAV, IBV) in vitro a causa del suo elevato contenuto di dimeri e trimeri di proantocianidine di tipo A (PAC-A).

Oximacro® e le sue PAC-A inibiscono la replicazione IAV e IBV

Oximacro® inibisce la replicazione di IAV e IBV in cellule MDCK in modo dipendente dalla concentrazione. I valori IC50 sono rispettivamente 4,5 ± 0,2 μg/ml per IAV e 4,5 ± 0,5 μg/ml per IBV. La concentrazione citotossica al 50% (CC50) è di 141 ± 0,8 μg/ml, indicando quindi che l’attività antivirale di Oximacro® non derivava da una citotossicità aspecifica. L’indice di selettività per IAV e IBV (CC50/IC50) risulta quindi rispettivamente di 31.1 e 31.3.

Anche contro il virus dell’influenza SOLO le PAC-A di Oximacro® hanno azione antivirale

Per individuare la frazione chimica di Oximacro® responsabile della sua attività inibitoria, sono stati eseguiti saggi antivirali con frazioni purificate ottenute mediante frazionamento di Oximacro® (vedi sopra). L’analisi dell’attività anti-IV delle frazioni ha identificato le frazioni 3 e 4 come aventi attività inibitoria nei confronti di IAV e IBV, indicando quindi che i componenti responsabili dell’attività antivirale di Oximacro® sono solo ed esclusivamente le PAC-A.

Oximacro® agisce nelle fasi iniziali del ciclo di riproduzione del virus dell’influenza.

Per capire il meccanisco d’azione di Oximacro®, sono state infettate cellule MDCK con IAV o IBV in presenza di diverse concentrazioni di Oximacro® per 2 ore a 4 ° C, in modo da consentire l’attacco di particelle IV, ma non il loro ingresso nelle cellule bersaglio. Oximacro® ha inibito l’attacco di IAV e IBV in modo dipendente dalla concentrazione (Figura A). Successivamente, per indagare l’attività inibitoria di Oximacro® sull’ingresso IV, monostrati di MDCK sono stati infettati con IV a 4 ° C per 2 ore per consentire l’attacco virale ma non l’ingresso. Sono state quindi aggiunte diverse concentrazioni di Oximacro® e le colture infette sono state incubate a 37 ° C per 2 ore per consentire l’ingresso di particelle IV adsorbite. Oximacro® ha impedito l’ingresso di IAV e IBV in modo dipendente dalla concentrazione (Figura B). Questi risultati dimostrano che Oximacro® è in grado di interferire sia con l’adesione virale sia con l’ingresso del virus nelle cellule, suggerendo quindi la sua idoneità come inibitore ad azione precoce della replicazione del virus dell’influenza.

Oximacro® interferisce con l’emoagglutinina del virus dell’influenza.

L’emoagglutinina (HA) del virus dell’influenza è responsabile sia dell’adesione che dell’ingresso del virus mediando sia l’interazione iniziale con i recettori cellulari contenenti acido sialico, sia la fusione tra le membrane endosomiche e l’involucro virale. Oximacro® è in grado di interagire con l’HA in modo dipendente dalla concentrazione e dal tempo e le interazioni tra Oximacro® e HA possono ostacolare le sue funzioni virali di adesione e ingresso del virus essendo alla base dell’attività antivirale complessiva di Oximacro®. Per identificare ulteriormente il meccanismo di interazione tra HA e le PAC-A di Oximacro®, sono state eseguite simulazioni di docking in silico. Utilizzando la struttura cristallina di HA (A / Porto Rico / 8/1934, ID PDB: 1RU7) del ceppo virale di influenza testato, l’analisi di docking ha rivelato che i dimeri PAC-A di Oximacro® si legano prima alle scanalature interne della struttura HA (Figura A, sinistra pannello), e successivamente alla superficie della struttura HA (Figura A, pannello di destra). La migliore posa di legame è mostrata nella Figura B, dove sono evidenziati i residui di HA (PHE 299, TRP 234 e ASN 210) che formano legami di idrogeno con i dimeri di PAC-A di Oximacro®.

Complessivamente, il meccanismo di azione descritto di Oximacro® contro il virus dell’influenza sostiene la sua potenziale applicazione come supporto per le infezioni influenzali.
Per una descrizione completa dei metodi e dei risultati si rimanda al documento:

LUGANINI, A., TERLIZZI, M.E., CATUCCI, G., GILARDI, G., MAFFEI, M.E., GRIBAUDO, G. (2018)
The cranberry extract Oximacro® exerts in vitro virucidal activity against influenza virus by interfering with hemagglutinin.
Frontiers in Microbiology, 9: 1826 – (download pdf).

SAGGIO DI INIBIZIONE DI BIOFILM IN ASSAY.

Oximacro® è stato testato per la sua capacità di inibire Escherichia coli 7402 in vitro, valutando l’effetto sul pilus Pap e sul pilus di tipo 1. Nelle infezioni urinarie dovute a Escherichia coli, l’operone fim codifica il pilo di tipo 1 (esprimendo un’emoagglutinazione che è sensibile al mannosio), mentre l’operone pap codifica pili P o Pap (che sono in grado di interagire con l’unità digalattoside nell’antigene del gruppo sanguigno P) (per maggiori informazioni vedi la pubblicazione di Terlizzi et al., 2017).

Il saggio biologico eseguito su E. coli indica che Oximacro® esercita la sua massima attività di inibizione a concentrazioni comprese tra 0,5 e 1,5 μg/ml, come mostrato nella figura seguente (media di due esperimenti ognuno con 5 repliche).

Per ulteriori informazioni su Escherichia coli UroPatogena, si prega di fare riferimento al documento:

Maria E. Terlizzi, Giorgio Gribaudo and Massimo E. Maffei (2017)
UroPathogenic Escherichia coli (UPEC) Infections: Virulence Factors, Bladder Responses, Antibiotic, and Non-antibiotic Antimicrobial Strategies.
Frontiers in Microbiology, 8: e1566 – (leggi l’articolo in linea).