METODI ANALITICI PER LA DETERMINAZIONE QUALITATIVA E QUANTITATIVA DEI CURCUMINOIDI DI OXITURMERIC®

I curcuminoidi di OxiTurmeric® sono analizzati mediante HPLC-DAD accoppiata a ESI- spettrometria di massa/massa. L’accurata quantificazione dei curcuminoidi curcumina (CUR), demetossicurcumina (DMC) e bis-demetossicurcumina (BDMC) di OxiTurmeric® si basa sul metodo ufficiale AOAC 2016.16. Dopo l’estrazione con metanolo e la dovuta diluizione, l’estratto viene analizzato mediante HPLC impostando il rivelatore DAD a 425 nm, la colonna C18 (2,6 μm, 2,1 × 30 mm) a 55 ° C di temperatura, utilizzando un volume di iniezione di 0,8 μL e un flusso velocità di 1,4 mL / min. Viene quindi calcolata la concentrazione reale dei curcuminoidi in base a curve di calibrazione ottenute su standard puri. L’identificazione dei curcuminoidi è effettuata tramite HPLC-DAD-ESI-MS/MS.

Molto spesso siamo abituati a vedere affermazioni di curcuminoidi presenti al 95-98%. Qui riportiamo un esempio di un campione di curcuma che vanta di possedere il 98% di curcuminoidi, ma che alla fine si è dimostrato contenere una percentuale reale del 63% di curcuminoidi totali. In pochi passaggi mostreremo come viene eseguita un’analisi tipica dei curcuminoidi.

Il cromatogramma ottenuto da un estratto commerciale di curcuma che vanta il 98% di curcuminoidi è riportato in Figura 1

Figura 1. Cromatogramma di un estratto di curcuma che vanta il 98% di curcuminoidi.

Leggendo a una lunghezza d’onda fissa (di 425 nm) si prevede che solo i curcuminoidi compaiano nel cromatogramma. Pertanto, se calcoliamo la percentuale totale dei curcuminoidi mostrati in Figura 1 otteniamo i risultati della Tabella 1, dove in realtà le percentuali totali di curcuminoidi sono addirittura superiori al 98% dichiarato.

Tabella 1. Percentuale totale delle aree dei picchi della Figura 1

Composto Tempo di ritenzione (min) Area calcolata Percentuale dell’area
Non identificato 13.03 134.14 0.7%
BDMC 14.88 2355.26 13.0%
DMC 15.34 3136.64 17.3%
Curcumin 15.81 12543.10 69.0%
TOTALE 18169.14 100.0%
Curcuminoidi totali 99.3%

Un errore comune è quello di considerare le percentuali della Tabella 1 come una misura quantitativa dei curcuminoidi presenti nell’estratto di curcuma analizzato. Per quantificare il contenuto reale dei curcuminoidi, la quantificazione viene eseguita con la calibrazione esterna rispetto agli standard di riferimento per CUR, DMC e BDMC, secondo il metodo ufficiale AOAC 2016.16. Per ottenere queste curve, la concentrazione dell’analita (asse x) viene tracciata rispetto all’area del picco integrato individuale per CUR, DMC e BDMC (asse y). L’analisi dei quadrati minimi e la retta di regressione vengono utilizzate per determinare la pendenza, l’intercetta e il coefficiente di determinazione (R2) della linea più adatta per ciascun analita.

Le Figure 2-4 mostrano le tipiche curve di calibrazione ottenute rispettivamente su standard puri di CUR, DMC e BDMC.

Figura 2. Curva di calibrazione calcolata con lo standard curcumina.

Figura 3. Curva di calibrazione calcolata con lo standard demetossicurcumina.

Figura 4. Curva di calibrazione calcolata con lo standard bisdemetossicurcumina.

Sulla base di queste curve di calibrazione esterne, la quantità di curcuminoidi nel campione originale viene calcolata come segue:

dove C = concentrazione dell’analita dalla curva standard; V = volume estratto; W = peso del campione saggiato (g); e D = fattore di diluizione.

Prendendo in considerazione il calcolo di cui sopra, i dati della Tabella 1 vengono quindi trasformati nei dati quantitativi della Tabella 2

 

Table 2. Analisi quantitativa dei dati della Tabella 1 e della Figura 1 in base alle curve di calibrazione delle Figure 2-4.

Composto Tempo di ritenzione (min) Area calcolata Percentuale dell’area μg dalla curva di cal. mg/g del campione % reale nel campione
Non identificato 13.03 134.14 0.7% nd nd
BDMC 14.88 2355.26 13.0% 0.023 45.7 4.6%
DMC 15.34 3136.64 17.3% 0.043 85.4 8.5%
Curcumin 15.81 12543.10 69.0% 0.248 492.7 49.3%
TOTALE 18169.14 100.0% 0.314 623.8 62.4%
Curcuminoidi totali 99.3% 62.4%

Pertanto, l’uso corretto delle curve di calibrazione mostra come la percentuale totale di curcuminoidi nel campione che vantava una percentuale totale di curcuminoidi del 98% è in realtà del 62,4%

Un’ulteriore conferma dell’identità dei curcuminoidi è data dall’accoppiamento dell’HPLC con una sorgente elettrospray e spettrometria di massa in tandem. Gli spettri di massa tipici di CUR, DMC e BDMC sono illustrati nelle Figure 5-7.

Figura 5. Frammentazione di massa della Curcumina.

Figura 6. Frammentazione di massa della Demetossicurcumina.

Figura 7. Frammentazione di massa della Bis-demetossicurcumina.

METODI ANALITICI PER LA DETERMINAZIONE QUANTITATIVA E QUALITATIVA DEI SISQUITERPENI BISABOLANICI VOLATILI DI OXITURMERIC®

I sesquiterpeni bisabolanici (ad es. Ar-turmerone, α-turmerone, β-turmerone) presenti in OxiTurmeric® sono identificati mediante gascromatografia accoppiata a spettrometria di massa (GC-MS) e quantificati mediante gascromatografia accoppiata a rivelatore a ionizzazione di fiamma (GC-FID ). Questi sono gli unici metodi affidabili per l’analisi dei composti bioattivi volatili della curcuma. Altri metodi (tra cui TLC, UV-Vis, ecc.) non forniscono né l’identificazione precisa dei composti (possibile solo tramite GC-MS) né la loro precisa quantificazione (ottenuta utilizzando GC-FID con curve di calibrazione esterne di standard puri e l’impiego di standard interni).

Il tipico profilo GC-FID di OxiTurmeric® è illustrato nella Figura 8.

Figura 8. Cromatogramma GC-FID di OxiTurmeric® che mostra la presenza di diversi sesquiterpeni. Questa analisi viene utilizzata per la determinazione quantitativa dei sesquiterpeni volatili bioattivi di OxiTurmeric® utilizzando sia le curve di calibrazione esterne con standard puri che tramite l’utilizzo di standard interni (come ad esempio il trans-nerolidolo).

L’identificazione dei principali sesquiterpeni di OxiTurmeric® è ottenuta tramite GC-MS come mostrato nella Figura 9.

Figura 9. Spettri di massa dei principali sesquiterpeni bisabolanici contenuti in OxiTurmeric®. Ogni singolo lotto è sottoposto a severi controlli GC-FID e GC-MS per fornire sempre un prodotto standardizzato.