VALUTAZIONE DELL’ATTIVITÀ ANTIOSSIDANTE CELLULARE DI OXI-P® SU CELLULE UMANE HEPG2

Attività antiossidante tramite la tecnologia LUCS

Oxi-P® è un fitocomplesso costituito da estratti vegetali selezionati che possiedono un elevato potere antiossidante.

I test chimici tradizionali come ORAC non informano sulle funzioni fisiologiche degli antiossidanti. Questi test sono stati screditati per anni e fortemente scoraggiati dalle principali autorità di monitoraggio sanitario (si veda ad esempio l’opinione dell’EFSA e dell’USDA). Lo studio degli effetti antiossidanti sui modelli di cellule vive rappresenta attualmente l’approccio più avanzato per dimostrare gli effetti fisiologici degli antiossidanti.

Abbiamo analizzato l’attività antiossidante di Oxi-P® utilizzando la tecnologia innovativa basata su LUCS (Light-Up Cell System) un approccio brevettato (EP2235505 e US20110008783) sviluppato dall’Azienda Anti Oxidant Power, Tolosa, Francia. Il test LUCS si basa sulla produzione di specie radicaliche cellulari dopo l’aggiunta nel mezzo di coltura di un biosensore di acidi nucleici fluorescente e fotoinducibile (come l’Arancio tiazolico, TO). L’effetto dell’applicazione della luce in presenza del biosensore cellulare innesca la produzione di un singoletto di ossigeno che a sua volta provoca la produzione di ROS (Specie Reattive dell’Ossigeno) in una cascata biochimica collegata all’aumento della fluorescenza emessa.

Il saggio LUCS misura la capacità di un estratto vegetale di neutralizzare lo stress ossidativo (vedi Figura 1).

Figura 1. Tecnologia LUCS. Il biosensore Arancio tiazolico (TO) viene aggiunto al terreno di coltura cellulare e diventa fluorescente dopo l’associazione con gli acidi nucleici delle cellule umane HepG2. Quando TO è fotoattivato dalla illuminazione con un LED a 480 nm, il suo cambiamento di stato è accompagnato da un trasferimento di energia alla molecola di ossigeno intracellulare (3O2) con conseguente produzione di singoletti di ossigeno (1O2) e una cascata di produzione di Specie Reattive dell’Ossigeno (ROS) come l’anione superossido (O2●-) e il radicale ossidrile (OH●). L’effetto antiossidante di un estratto vegetale può quindi essere misurato dalla sua capacità di contrastare questa produzione di ROS intracellulare.

L’effetto è misurato da un ritardo nell’evoluzione cinetica dell’emissione di fluorescenza. L’approccio è stato standardizzato su piastre a 96 pozzetti ad alta produttività per consentire analisi statistiche affidabili.

METODOLOGIA UTILIZZATA CON Oxi-P®: per valutare l’attività antiossidante di Oxi-P®, le cellule HepG2 sono state prima seminate in piastre da 96 pozzetti con una densità di 75.000 cellule/pozzetto in terreno di Eagle modificato da Dulbecco (DMEM) integrato con siero fetale bovino (FCS) e conservate nell’incubatore per 24 ore a 37 °C con 5% di CO2. Le cellule sono state quindi incubate in presenza di Oxi-P® (8 concentrazioni ottenute con diluizioni seriali log2) per 4 ore a 37 °C con 5% di CO2. Gli esperimenti sono stati realizzati su supporto DMEM senza FCS. Sono stati realizzati almeno due esperimenti indipendenti in triplicato ciascuno. Le cellule sono state trattate dopo l’incubazione di 4 ore con il biosensore fluorescente per 1 ora e la fluorescenza è stata misurata (RFU a 535 nm) secondo una ricorrente procedura con LED a 480 nm (20 iterazioni) dell’intera piastra a 96 pozzetti. I profili cinetici sono stati quindi registrati e sono state ottenute le curve dose-risposta. L’Indice Antiossidante Cellulare (indice AOP) è stato quindi calcolato da profili cinetici normalizzati secondo la formula:

Indice AOP (%) = 100 – 100 (020 RFUOxi-P® / 020 RFUcontrollo)

Le curve dose-risposta, ottenute calcolando gli indici AOP in base al logaritmo su base 10 della concentrazione del campione, vengono sottoposte a un adattamento sigmoideo secondo la formula:

Indice AOP = = AOPindicemin + (AOPindicemax – AOPindicemin)/(1 + 10(Log(EC50-SC)*HS))

dove SC = concentrazione di Oxi-P® e HS = pendenza di Hill. Vengono quindi valutati EC50, EC10 ed EC90.

OXI-P® MOSTRA UNA FORTE ATTIVITÀ ANTIOSSIDANTE SULLE CELLULE UMANE HEPG2

Oxi-P® mostra un forte potere antiossidante diretto sulle cellule umane HepG2, con un indice antiossidante (AOP) di 925 (massimo teorico = 1000) alla concentrazione di 5 mg/ml. Oxi-P® mostra anche un significativo effetto antiossidante a 2,50 mg/ml, mentre un effetto del 90% si raggiunge a 4,71 mg/ml.

I dati cinetici sono mostrati in Figura 2, mentre i dati di dose-risposta sono illustrati nella Figura 3.

Figura 2. L’effetto antiossidante intracellulare è rivelato da un ritardo temporale nell’aumento della fluorescenza innescato dalla fotoattivazione del TO dipendente dal LED. Il grafico mostra i profili di fluorescenza delle cellule umane HepG2 trattate per 4 ore a diverse concentrazioni di Oxi-P®. La curva di controllo (Ctrl DMEM medium) è illustrata in nero. Le differenze di area di campione sottese alle curve (AUC) tra il controllo e Oxi-P® consentono di stabilire un indice (indice AOP) che qualifica l’effetto antiossidante intracellulare di Oxi-P®. I dati mostrano anche che Oxi-P® non è citotossico.

Figura 3. Il calcolo dell’indice LUCS a diverse concentrazioni di Oxi-P® consente di stabilire profili dose-effetto che si adattano bene alla regressione sigmoidea, consentendo la valutazione dell’EC10 (Concentrazione Efficace del 10%, soglia dell’effetto cellulare), lo standard EC50 (Concentrazione Efficace del 50%) e l’EC90 (Concentrazione Efficace del 90%, dose più debole a cui il composto agisce con un effetto massimo). La figura illustra la curva dose-effetto ottenuta dopo il trattamento con Oxi-P® dopo 4 ore su cellule umane HepG2.

Questi risultati quantitativi mostrano che OxiP-® è efficace sulle cellule umane HepG2 esercitando un forte effetto antiossidante. Questi dati possono essere utilizzati come riferimenti su cellule umane per migliorare i processi di preparazione dei prodotti basati su Oxi-P®.

Per ulteriori informazioni sulla tecnologia LUCS, fare riferimento ai seguenti link:

https://antioxidant-power.com/en/lucs-technology/

https://www.nature.com/articles/s41598-017-18211-2.pdf